期刊：MoleculesIF=3.
发表时间：.04
01研究背景
荞麦属于蓼科荞麦属。苦荞麦和普通荞麦是其中两个主要种类，被认为是亚欧的替代作物或次要谷物。苦荞麦和普通荞麦传统上被认为是药食同源作物，因为它们的谷物具有高含量的淀粉、膳食纤维，以及蛋白质。此外，它们也是唯一含有芦丁的谷物。
*酮类化合物是一组重要的植物次生代谢产物，研究表明，类*酮具有许多生物学功能，并与人类健康息息相关，如抗氧化，抗糖尿病，抗炎和抗高血压等。但由于人体和动物不能合成类*酮，植物中的*酮类化合物在我们的饮食中显得尤为重要。目前，苦荞麦和普通荞麦已被制成一系列消费食品，如煎饼，面包，面条和茶。但是，只有他们的谷物用于食品生产。而类*酮的积累是有组织特异性的，在苦荞麦和普通荞麦中，叶片中的*酮含量高于籽粒中，在开花期间和种子形成期间，普通荞麦中的芦丁含量甚至高于花中。此外，荞麦具有相当大的叶生物量，因此，荞麦叶具有很大的利用潜力。在这项研究中，采用UPLC-ESI-MS/MS技术、聚类分析，PCA分析，OPLS-DA分析来研究苦荞和普通荞麦叶中的类*酮代谢物的差异，为利用荞麦叶提供理论依据。
02方法流程
材料：1个苦荞麦品种和3个普通荞麦品种
试剂盒测定样品中的总*酮含量
↓
基于UPLC-ESI-MS/MS检测样品中的*酮类代谢物
↓
PCA分析
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OPLS-DA分析
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差异代谢物的功能注释和富集分析
03研究结果
1.总*酮含量的测定
在这项研究中，一个苦荞麦品种“西农”（KL1）和三个普通荞麦品种“北早生”（TL1），“西农”（TL2）和“西农”（TL3）被选为实验品种。研究了四种荞麦品种叶中总*酮含量（图1）。TL3的类*酮含量显著高于TL1和TL2（p0.05），达到.04mg/gDW，略高于KL1，但差异不显著（p0.05）。来自苦荞麦的叶片中的类*酮含量在.66mg/gDW，为第二高。TL2的类*酮含量显著高于TL1（p0.05）。TL1具有最低的*酮类化合物含量为.95mg/gDW。
图1各荞麦品种中的总*酮含量
2.代谢物分析
基于UPLC-ESI-MS/MS技术和数据库，研究了4个荞麦品种叶片的*酮类代谢产物。在该研究中，鉴定了种*酮类代谢物，包括53种*酮，37种*酮醇，32种*酮C-糖苷，24种*烷酮，18种花色素苷，7种异*酮，6种*酮木脂素和5种原花色素（图2）。在热图中，KL1中*酮类代谢物的含量与TL1，TL2和TL3相比差异很大，而TL1，TL2和TL3中*酮类代谢物的含量基本一致，表明苦荞麦与三种常见的荞麦品种明显不同。同时，通过聚类分析所有*酮类代谢物，KL1中一半以上的*酮类代谢物含量高于TL1，TL2和TL3。
图2*酮类代谢物的聚类热图
3.*酮类差异代谢物的PCA分析
在这项研究中，提取了两个主要成分PC1和PC2，分别为53.49％和19.77％，累计贡献率达到73.26％。在PCA得分图（图3A）中，KL1，TL1，TL2和TL3被清楚地分开，并且重复的样品紧密地聚集在一起，从而表明该实验是可重复且可靠的。KL1与TL1，TL2和TL3的明显分离表明它们之间存在很大差异。在PCA载荷图（图3B）中，不同类别的类*酮代谢物分布在不同的象限中。通过比较得分图，发现花青素，*烷酮和*酮C-糖苷对TL1，TL2和TL3贡献较大，其他类*酮对KL1有贡献。这些*酮类化合物含量的差异可能是苦荞麦和普通荞麦之间差异的主要原因。
图3A：样本的PCA得分图，B：*酮类代谢物的载荷图
4.*酮类差异代谢物的OPLS-DA分析
OPLS-DA是一种发现差异代谢物的有效方法，因为它可以最大化群体之间的区别。Q2是评估OPLS-DA模型的重要参数。Q2值大于0.9表明了一个优秀的模型。在该研究中，基于OPLS-DA模型成对比较样品中的类*酮代谢物含量，以评估KL1和TL2之间的差异（R2X=0.，R2Y=1，Q2=0.;图4A），在KL1和TL2之间（R2X=0.，R2Y=1，Q2=0.;图4B），KL1和TL3之间（R2X=0.，R2Y=1，Q2=0.;图4C），TL1和TL2之间（R2X=0.，R2Y=0.，Q2=0.;图4A），在TL1和TL3之间（R2X=0.，R2Y=1，Q2=0.;图4E），以及TL2和TL3之间（R2X=0.，R2Y=1，Q2=0.;图4F）。所有对照组的Q2值均超过0.9，从而证明这些模型稳定可靠，可用于进一步筛选差异类*酮代谢物。
图4样本之间的OPLS-DA分析
5.*酮类差异代谢物的鉴定、功能注释和富集分析
通过OPLS-DA模型的VIP值和FC值来鉴定筛选每个比较组中的*酮类差异代谢物。筛选标准为FC≥2或≤0.5以及VIP值≥1。结果显示，KL1和TL1之间有53种显著不同的类*酮代谢物（35种下调，18种上调），KL1和TL2之间有61种（下调39种，上调22种），KL1和TL3间有62种（37种下调，25种上调），TL1和TL2之间40种（下调16种，上调24种），TL1和TL3间有34种（下调8种，上调26种），TL2和TL3间40种（9种下调，31种上调）。与苦荞相比，普通荞麦的大部分*酮类代谢产物均下调。
在维恩图（图5A）中取每个比较组的交叉点后，在比较组KL1与TL1，KL1与TL2和KL1与TL3之间观察到44种常见的差异代谢物。然而，在比较组TL1与TL2，TL1与TL3以及TL2与TL3之间仅显示8种常见的差异代谢物。结果表明造成KL1、TL1、TL2、TL3差异的*酮类代谢物是基本一致的。
来自每个比较组的差异类*酮代谢物由（KEGG）数据库注释。KEGG分类结果表明，对照组的差异类*酮代谢物参与了花青素的合成、*酮和*酮醇的合成、异*酮的合成、次生代谢物的合成、类*酮的合成、苯丙酸合成及代谢通路等。
图5样本韦恩图、差异代谢物的通路富集
04研究结论
在这项研究中，选择了四种重要的荞麦品种作为实验材料，包括一种苦荞麦和三种常见的荞麦品种。红花荞麦（TL3）叶片中总*酮含量最高，其次是苦荞叶。基于UPLC-ESI-MS/MS，共鉴定出种类*酮代谢物。通过聚类分析，主成分分析（PCA），正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），可以清楚地分离出不同的样本。在苦荞叶和普通荞麦叶之间的类*酮代谢物差异较大，并且两者都显示出具有重要生物学功能的独特代谢物。本研究为苦荞麦与普通荞麦叶片中*酮类代谢产物的差异提供了新的见解，为荞麦的充分利用提供了理论依据。
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